Tato práce se zabývá stanovením mitochondriální DNA (mtDNA) a jejím významem v patologických stavech člověka. Mitochondrie patří mezi buněčné organely eukaryotických buněk, jsou důležité zejména pro jejich energetický metabolismus a mají významnou roli v procesu stárnutí a apoptózy. Podle recentních studií se mitochondriální dysfunkce kromě mitochondriálních onemocnění podílí také na běžných onemocněních, jako jsou nemoci srdce, mozku nebo rakovina. Ukazuje se, že počet mitochondrií v buňkách koreluje se zdravotním stavem a stárnutím organismu. Buněčný obsah mtDNA se často měří jako poměr mtDNA k jaderné DNA. Měření mtDNA z periferní krve se ukazuje jako vhodný ukazatel mitochondriálních funkcí, neboť snížené množství mtDNA může korelovat se sníženou funkcí mitochondrií. Dosud nebylo objasněno, jak hladina mtDNA ovlivňuje vznik onemocnění, ale ukazuje se, že by mohla být biomarkerem pro kontrolu zdravotního stavu v čase.
Praktická část popisuje přípravu vzorků z bukálních stěrů a periferní krve a metodu stanovení mtDNA pomocí real-time PCR. Výpočet počtu kopií mtDNA z naměřených hodnot a jejich vyhodnocení. V rámci optimalizace měření je uvedeno srovnání dvou různých přístupů pro diagnostiku relativního počtu kopií mtDNA.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis dealing with measuring mitochondrial DNA (mtDNA) and how is it important to pathological conditions. Mitochondria are one of the cell organelles in eukaryotic cells. They are important to energy metabolism, aging process, and apoptosis. In current studies mitochondrial dysfunctions cause mitochondrial diseases and common illnesses, for example cardiovascular diseases, brain pathology or cancer. Studies show, that copy number of mtDNA correlates with state of health and aging process. Copy number of mtDNA is often measured by ratio of mtDNA to nuclear DNA. Measuring mtDNA of peripheral blood is appropriate indicators for mitochondrial functions because decreased copy number of mtDNA correlates with decreased function of mitochondria. We don't know, how copy number of mtDNA influence on illnesses, because it doesn't still clarify. However, studies show, that copy number of mtDNA can be biomarker of control of state of health, when we take real time measurement.
In the practical part of this bachelor thesis describe preparation of samples from buccal swabs and from peripheral blood. It also describes method of measuring mtDNA by real-time PCR. There is calculation of copy number of mtDNA and evaluation of our results too. As part of the measurement optimization are described differences between two methods for diagnostic of relative copy number of mtDNA.
Klíčová slova
Mitochondrie, mtDNA, počet kopií mtDNA, zdravotní stav, biomarker, real-time PCR
Klíčová slova v angličtině
Mitochondria, mtDNA, mtDNA copy number, state of health, biomarker, real-time PCR
Rozsah průvodní práce
78 s. (115 283 znaků)
Jazyk
CZ
Anotace
Tato práce se zabývá stanovením mitochondriální DNA (mtDNA) a jejím významem v patologických stavech člověka. Mitochondrie patří mezi buněčné organely eukaryotických buněk, jsou důležité zejména pro jejich energetický metabolismus a mají významnou roli v procesu stárnutí a apoptózy. Podle recentních studií se mitochondriální dysfunkce kromě mitochondriálních onemocnění podílí také na běžných onemocněních, jako jsou nemoci srdce, mozku nebo rakovina. Ukazuje se, že počet mitochondrií v buňkách koreluje se zdravotním stavem a stárnutím organismu. Buněčný obsah mtDNA se často měří jako poměr mtDNA k jaderné DNA. Měření mtDNA z periferní krve se ukazuje jako vhodný ukazatel mitochondriálních funkcí, neboť snížené množství mtDNA může korelovat se sníženou funkcí mitochondrií. Dosud nebylo objasněno, jak hladina mtDNA ovlivňuje vznik onemocnění, ale ukazuje se, že by mohla být biomarkerem pro kontrolu zdravotního stavu v čase.
Praktická část popisuje přípravu vzorků z bukálních stěrů a periferní krve a metodu stanovení mtDNA pomocí real-time PCR. Výpočet počtu kopií mtDNA z naměřených hodnot a jejich vyhodnocení. V rámci optimalizace měření je uvedeno srovnání dvou různých přístupů pro diagnostiku relativního počtu kopií mtDNA.
Anotace v angličtině
This bachelor thesis dealing with measuring mitochondrial DNA (mtDNA) and how is it important to pathological conditions. Mitochondria are one of the cell organelles in eukaryotic cells. They are important to energy metabolism, aging process, and apoptosis. In current studies mitochondrial dysfunctions cause mitochondrial diseases and common illnesses, for example cardiovascular diseases, brain pathology or cancer. Studies show, that copy number of mtDNA correlates with state of health and aging process. Copy number of mtDNA is often measured by ratio of mtDNA to nuclear DNA. Measuring mtDNA of peripheral blood is appropriate indicators for mitochondrial functions because decreased copy number of mtDNA correlates with decreased function of mitochondria. We don't know, how copy number of mtDNA influence on illnesses, because it doesn't still clarify. However, studies show, that copy number of mtDNA can be biomarker of control of state of health, when we take real time measurement.
In the practical part of this bachelor thesis describe preparation of samples from buccal swabs and from peripheral blood. It also describes method of measuring mtDNA by real-time PCR. There is calculation of copy number of mtDNA and evaluation of our results too. As part of the measurement optimization are described differences between two methods for diagnostic of relative copy number of mtDNA.
Klíčová slova
Mitochondrie, mtDNA, počet kopií mtDNA, zdravotní stav, biomarker, real-time PCR
Klíčová slova v angličtině
Mitochondria, mtDNA, mtDNA copy number, state of health, biomarker, real-time PCR
Zásady pro vypracování
1. Současný stav dané problematiky:
Mitochondrie jsou eukaryotické organely důležité pro energetický metabolismus a hrají velkou roli v procesu stárnutí a apoptózy. Podle nových studií se mitochondriální dysfunkce, kromě mitochondriálních onemocnění, podílí také na běžných onemocněních, jako jsou onemocnění srdce, mozku nebo rakovina. Ukazuje se, že počet mitochondrií v buňkách koreluje se zdravotním stavem a stárnutím organismu. Buněčný obsah mitochondriální DNA (mtDNA) se často měří jako poměr mtDNA ku jaderné DNA. Měření mtDNA z periferní krve se ukazuje jako dobrý ukazatel mitochondriální funkce, neboť snížené množství mtDNA může korelovat se sníženou funkcí mitochondrií. Dosud nebylo objasněno, jak hladina mtDNA ovlivňuje vznik onemocnění, ale ukazuje se, že by mohla být bioindikátorem pro kontrolu zdravotního stavu.
2. Cíle práce:
1. Optimalizace metody real-time PCR kvantifikující mtDNA pro zavedení metody do klinické praxe.
2. Zvládnutí interpretace výsledků a statistická analýza dat.
3.Hypotézy:
"Muži mají vyšší hladiny mtDNA než ženy."
"U lidí s vyšším věkem klesá počet kopií mtDNA."
"Souvisí subjektivní/objektivní pocit zdraví s počtem kopií mtDNA."
V rámci optimalizace srovnáme komerční diagnostický kit Human Mitochondrial DNA (mtDNA) Monitoring Primer Set od výrobce Takara Bio Inc., který je přímo určený na stanovení počtu kopií mitochondriální DNA, a "in house" metodu využívající reagencie od firmy Top Bio s.r.o. a vybrané primerové sekvence.
Na základě získaných výsledků zjistíme, která metoda je vhodnější pro stanovení mtDNA a naměřená data použijeme také pro zodpovězení stanovených hypotéz.
4.Popis metodiky:
Pro metodu stanovení počtu kopií mitochondriální DNA použijeme metodu Real-time PCR. DNA získáme ze vzorků bukálních stěrů a/nebo periferní krve. DNA izolace provedeme kolonkovou adsorbční metodou a přímou izolací ze vzorků. Změříme koncentraci získané DNA ze vzorku. Pomocí Real-time PCR analyzátoru získáme CT hodnoty a z těch vypočteme hodnoty počtu kopií mitochondriální DNA. Získaná data budou analyzována a statisticky zpracována.
5.Předpokládané využití práce v praxi:
Výsledky práce mohou sloužit k dalšímu studiu a rozvedení dané problematiky. Vyšetření bude možné zavést do klinické praxe.
Zásady pro vypracování
1. Současný stav dané problematiky:
Mitochondrie jsou eukaryotické organely důležité pro energetický metabolismus a hrají velkou roli v procesu stárnutí a apoptózy. Podle nových studií se mitochondriální dysfunkce, kromě mitochondriálních onemocnění, podílí také na běžných onemocněních, jako jsou onemocnění srdce, mozku nebo rakovina. Ukazuje se, že počet mitochondrií v buňkách koreluje se zdravotním stavem a stárnutím organismu. Buněčný obsah mitochondriální DNA (mtDNA) se často měří jako poměr mtDNA ku jaderné DNA. Měření mtDNA z periferní krve se ukazuje jako dobrý ukazatel mitochondriální funkce, neboť snížené množství mtDNA může korelovat se sníženou funkcí mitochondrií. Dosud nebylo objasněno, jak hladina mtDNA ovlivňuje vznik onemocnění, ale ukazuje se, že by mohla být bioindikátorem pro kontrolu zdravotního stavu.
2. Cíle práce:
1. Optimalizace metody real-time PCR kvantifikující mtDNA pro zavedení metody do klinické praxe.
2. Zvládnutí interpretace výsledků a statistická analýza dat.
3.Hypotézy:
"Muži mají vyšší hladiny mtDNA než ženy."
"U lidí s vyšším věkem klesá počet kopií mtDNA."
"Souvisí subjektivní/objektivní pocit zdraví s počtem kopií mtDNA."
V rámci optimalizace srovnáme komerční diagnostický kit Human Mitochondrial DNA (mtDNA) Monitoring Primer Set od výrobce Takara Bio Inc., který je přímo určený na stanovení počtu kopií mitochondriální DNA, a "in house" metodu využívající reagencie od firmy Top Bio s.r.o. a vybrané primerové sekvence.
Na základě získaných výsledků zjistíme, která metoda je vhodnější pro stanovení mtDNA a naměřená data použijeme také pro zodpovězení stanovených hypotéz.
4.Popis metodiky:
Pro metodu stanovení počtu kopií mitochondriální DNA použijeme metodu Real-time PCR. DNA získáme ze vzorků bukálních stěrů a/nebo periferní krve. DNA izolace provedeme kolonkovou adsorbční metodou a přímou izolací ze vzorků. Změříme koncentraci získané DNA ze vzorku. Pomocí Real-time PCR analyzátoru získáme CT hodnoty a z těch vypočteme hodnoty počtu kopií mitochondriální DNA. Získaná data budou analyzována a statisticky zpracována.
5.Předpokládané využití práce v praxi:
Výsledky práce mohou sloužit k dalšímu studiu a rozvedení dané problematiky. Vyšetření bude možné zavést do klinické praxe.
Seznam doporučené literatury
REFINETTI, P., WARREN, D., MORGENTHALER, S., EKSTRØM, P.O., 2017. Quantifying mitochondrial DNA copy number using robust regression to interpret real time PCR results. BMC Research Notes [online]. 13 November 2017, 10(1) [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.1186/s13104-017-2913-1. ISSN 1756-0500. Dostupné z: https://bmcresnotes.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13104-017-2913-1
LONGCHAMPS, R.J. et al., 2020. Evaluation of mitochondrial DNA copy number estimation techniques. PLOS ONE [online]. 31 January 2020, 15(1) [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.1371/journal.pone.0228166. ISSN 1932-6203. Dostupné z: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0228166
FUKUNAGA, H., 2021. Mitochondrial DNA Copy Number and Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD). International Journal of Molecular Sciences [online]. 21 June 2021, 22(12) [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.3390/ijms22126634. ISSN 1422-0067. Dostupné z: https://www.mdpi.com/1422-0067/22/12/6634
XIA, C.-Y. et al., 2017. Reference Intervals of Mitochondrial DNA Copy Number in Peripheral Blood for Chinese Minors and Adults. Chinese Medical Journal [online]. 20 October 2017, 130(20), 2435-2440 [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.4103/0366-6999.216395. ISSN 0366-6999. Dostupné z: https://journals.lww.com/00029330-201710200-00007
FILOGRANA, R., MENNUNI, M., ALSINA, D., LARSSON, N.‐G., 2021. Mitochondrial DNA copy number in human disease: The more the better?. FEBS Letters [online]. 12 December 2020, 595(8), 976-1002 [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.1002/1873-3468.14021. ISSN 0014-5793. Dostupné z: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1873-3468.14021
Seznam doporučené literatury
REFINETTI, P., WARREN, D., MORGENTHALER, S., EKSTRØM, P.O., 2017. Quantifying mitochondrial DNA copy number using robust regression to interpret real time PCR results. BMC Research Notes [online]. 13 November 2017, 10(1) [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.1186/s13104-017-2913-1. ISSN 1756-0500. Dostupné z: https://bmcresnotes.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13104-017-2913-1
LONGCHAMPS, R.J. et al., 2020. Evaluation of mitochondrial DNA copy number estimation techniques. PLOS ONE [online]. 31 January 2020, 15(1) [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.1371/journal.pone.0228166. ISSN 1932-6203. Dostupné z: https://dx.plos.org/10.1371/journal.pone.0228166
FUKUNAGA, H., 2021. Mitochondrial DNA Copy Number and Developmental Origins of Health and Disease (DOHaD). International Journal of Molecular Sciences [online]. 21 June 2021, 22(12) [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.3390/ijms22126634. ISSN 1422-0067. Dostupné z: https://www.mdpi.com/1422-0067/22/12/6634
XIA, C.-Y. et al., 2017. Reference Intervals of Mitochondrial DNA Copy Number in Peripheral Blood for Chinese Minors and Adults. Chinese Medical Journal [online]. 20 October 2017, 130(20), 2435-2440 [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.4103/0366-6999.216395. ISSN 0366-6999. Dostupné z: https://journals.lww.com/00029330-201710200-00007
FILOGRANA, R., MENNUNI, M., ALSINA, D., LARSSON, N.‐G., 2021. Mitochondrial DNA copy number in human disease: The more the better?. FEBS Letters [online]. 12 December 2020, 595(8), 976-1002 [cit. 2022-4-11]. DOI: 10.1002/1873-3468.14021. ISSN 0014-5793. Dostupné z: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1873-3468.14021