Hlavním tématem předkládané práce je analýza sekvencí genu ORMDL3, který je identifikován jako potenciální rizikový faktor řady onemocnění, přičemž nejdiskutovanějším z nich je dětské astma. Tento gen je členem skupiny genů ORMDL, kódující transmembránové proteiny ukotvené v endoplazmatickém retikulu. ORMDL3 je u člověka lokalizován na chromozomu 17, v oblasti 17q21.1.
V teoretické části práce jsou blíže specifikována autoimunitní onemocnění, na jejichž vzniku a rozvoji se mutace v genu ORMDL3 do určité míry podílí. Těmito onemocněními je již zmíněné astma, dále Crohnova choroba, revmatoidní artritida, inzulin dependentní diabetes mellitus a primární biliární cirhóza. Následně je zde popsána metoda Sangerova sekvenování, pomocí níž byly vzorky sekvenovány, a novodobá metoda NGS.
Praktická část práce je zaměřena na přípravu vzorků pro Sangerovo sekvenování
a hodnocení sekvenačních dat. K amplifikaci požadovaného úseku pro sekvenační reakci byla použita metoda PCR. Takto bylo připraveno 20 anonymizovaných vzorků DNA.K sekvenování firmou Genseq s.r.o. bylo odesláno 15 vzorků. Dále bylo hodnoceno 20 poskytnutých vzorků, z nichž 10 bylo od dětí z Českobudějovicka a 10 od dětí z Karvinska. Také tyto vzorky byly anonymizovány.
Pro analýzu sekvencí jednotlivých vzorků DNA byl využit volně přístupný program BioEdit a databáze NCBI. Sekvence byly přečteny z obou stran (forward a reverse), nalezené mutace identifikovány a výsledná data zaznamenána do grafů. Po přečtení vlastních sekvencí byla u 5 z 15 vzorků přítomna heterozygotní mutace. Stejná mutace byla přítomna také v poskytnutých sekvencích, konkrétně u 8 z 10 Českobudějovických a 3 z 10 Karvinských. Tato mutace není v databázi NCBI dosud popsána.
Anotace v angličtině
The main topic of the presented bachelor thesis is a sequence analysis of the ORMDL3 gene, which is identified as a potential risk factor for many diseases, the most discussed of which is childhood asthma. This gene is a member of the ORMDL gene family, which encodes transmembrane proteins anchored in the endoplasmic reticulum. In humans, ORMDL3 is located on chromosome 17, in region 17q21.1.
In the theoretical part of the thesis the autoimmune diseases, on which origin and development the mutations in the ORMDL3 gene participate to a certain extent, are specified. These diseases include the aforementioned asthma, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, insulin-dependent diabetes mellitus and primary biliary cirrhosis. Also, the Sanger sequencing method by which the samples were sequenced, and the modern NGS method are described here.
The practical part of the thesis is focused on preparation of samples for Sanger sequencing, and evaluation of sequencing data. To amplify the desired region for the sequencing reaction, the PCR method was used. 20 anonymized DNA samples were prepared this way. For sequencing by Genseq s.r.o. 15 samples were sent. Furthermore, 20 provided samples were evaluated, 10 of which were from children from the České Budějovice region and 10 from children from the Karviná region. These samples were also anonymized.
To analyze the sequences of individual DNA samples, freely available BioEdit program and the NCBI database was used. The sequences were read from both sides (forward and reverse), the found mutations were identified and the resulting data were plotted in graphs. After the sequences were read, a heterozygous mutation was present in 5 of the 15 samples. The same mutation was also present in the provided sequences, specifically in 8 out of 10 from České Budějovice and 3 out of 10 from Karviná. This mutation has not yet been described in the NCBI database.
Hlavním tématem předkládané práce je analýza sekvencí genu ORMDL3, který je identifikován jako potenciální rizikový faktor řady onemocnění, přičemž nejdiskutovanějším z nich je dětské astma. Tento gen je členem skupiny genů ORMDL, kódující transmembránové proteiny ukotvené v endoplazmatickém retikulu. ORMDL3 je u člověka lokalizován na chromozomu 17, v oblasti 17q21.1.
V teoretické části práce jsou blíže specifikována autoimunitní onemocnění, na jejichž vzniku a rozvoji se mutace v genu ORMDL3 do určité míry podílí. Těmito onemocněními je již zmíněné astma, dále Crohnova choroba, revmatoidní artritida, inzulin dependentní diabetes mellitus a primární biliární cirhóza. Následně je zde popsána metoda Sangerova sekvenování, pomocí níž byly vzorky sekvenovány, a novodobá metoda NGS.
Praktická část práce je zaměřena na přípravu vzorků pro Sangerovo sekvenování
a hodnocení sekvenačních dat. K amplifikaci požadovaného úseku pro sekvenační reakci byla použita metoda PCR. Takto bylo připraveno 20 anonymizovaných vzorků DNA.K sekvenování firmou Genseq s.r.o. bylo odesláno 15 vzorků. Dále bylo hodnoceno 20 poskytnutých vzorků, z nichž 10 bylo od dětí z Českobudějovicka a 10 od dětí z Karvinska. Také tyto vzorky byly anonymizovány.
Pro analýzu sekvencí jednotlivých vzorků DNA byl využit volně přístupný program BioEdit a databáze NCBI. Sekvence byly přečteny z obou stran (forward a reverse), nalezené mutace identifikovány a výsledná data zaznamenána do grafů. Po přečtení vlastních sekvencí byla u 5 z 15 vzorků přítomna heterozygotní mutace. Stejná mutace byla přítomna také v poskytnutých sekvencích, konkrétně u 8 z 10 Českobudějovických a 3 z 10 Karvinských. Tato mutace není v databázi NCBI dosud popsána.
Anotace v angličtině
The main topic of the presented bachelor thesis is a sequence analysis of the ORMDL3 gene, which is identified as a potential risk factor for many diseases, the most discussed of which is childhood asthma. This gene is a member of the ORMDL gene family, which encodes transmembrane proteins anchored in the endoplasmic reticulum. In humans, ORMDL3 is located on chromosome 17, in region 17q21.1.
In the theoretical part of the thesis the autoimmune diseases, on which origin and development the mutations in the ORMDL3 gene participate to a certain extent, are specified. These diseases include the aforementioned asthma, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, insulin-dependent diabetes mellitus and primary biliary cirrhosis. Also, the Sanger sequencing method by which the samples were sequenced, and the modern NGS method are described here.
The practical part of the thesis is focused on preparation of samples for Sanger sequencing, and evaluation of sequencing data. To amplify the desired region for the sequencing reaction, the PCR method was used. 20 anonymized DNA samples were prepared this way. For sequencing by Genseq s.r.o. 15 samples were sent. Furthermore, 20 provided samples were evaluated, 10 of which were from children from the České Budějovice region and 10 from children from the Karviná region. These samples were also anonymized.
To analyze the sequences of individual DNA samples, freely available BioEdit program and the NCBI database was used. The sequences were read from both sides (forward and reverse), the found mutations were identified and the resulting data were plotted in graphs. After the sequences were read, a heterozygous mutation was present in 5 of the 15 samples. The same mutation was also present in the provided sequences, specifically in 8 out of 10 from České Budějovice and 3 out of 10 from Karviná. This mutation has not yet been described in the NCBI database.
Gen ORMDL3 (ORM1-LIKE PROTEIN 3, * 610075) je u člověka lokalizován na chromozomu 17, v oblasti 17q21.1. Obsahuje celkem 6 exonů, z toho 3 kódující, čítá celkem přes 2 tisíce bází. Rodina genů ORM, zahrnující ORMDL3, byla identifikována jako potenciální rizikový faktor pro dětské astma. ORM proteiny působí jako negativní regulátory syntézy sfingolipidů. Změny v expresi ORM genu nebo mutace na jejich fosforylačních místech způsobují dysregulaci metabolismu sfingolipidů. Nesprávná regulace sfingolipidů přispívá k rozvoji dětského astmatu.
Cíl práce:
1. Osvojit si základní metody molekulární biologie - izolace DNA, PCR, sekvenování, hodnocení sekvencí.
2. Srovnat výskyt nalezených mutací v genu ORMDL3 mezi populacemi dětí z Karvinska a Českobudějovicka.
Výzkumné otázky:
Liší se výskyt mutací mezi populacemi dětí z Karvinska a Českobudějovicka?
Popis metodiky:
Ze vzorků bukálních stěrů bude provedena izolace DNA, dále bude následovat amplifikace příslušného genu pomocí metody PCR. Poté budou vzorky osekvenovány. Následovat bude hodnocení sekvencí a klasifikace nalezených mutací. Předpokládá se vyšetření cca patnácti vzorků, hodnoceny budou ještě vzorky vyšetřené v předchozím období.
Předpokládané využití práce v praxi:
Bude ověřeno, že metodiku sekvenování z primárního vzorku bukálního stěru lze použít v klinikcké praxi. Výsledek by měl přispět ke vztahu výskytu mutací v závislosti na prostředí.
Zásady pro vypracování
Současný stav dané problematiky:
Gen ORMDL3 (ORM1-LIKE PROTEIN 3, * 610075) je u člověka lokalizován na chromozomu 17, v oblasti 17q21.1. Obsahuje celkem 6 exonů, z toho 3 kódující, čítá celkem přes 2 tisíce bází. Rodina genů ORM, zahrnující ORMDL3, byla identifikována jako potenciální rizikový faktor pro dětské astma. ORM proteiny působí jako negativní regulátory syntézy sfingolipidů. Změny v expresi ORM genu nebo mutace na jejich fosforylačních místech způsobují dysregulaci metabolismu sfingolipidů. Nesprávná regulace sfingolipidů přispívá k rozvoji dětského astmatu.
Cíl práce:
1. Osvojit si základní metody molekulární biologie - izolace DNA, PCR, sekvenování, hodnocení sekvencí.
2. Srovnat výskyt nalezených mutací v genu ORMDL3 mezi populacemi dětí z Karvinska a Českobudějovicka.
Výzkumné otázky:
Liší se výskyt mutací mezi populacemi dětí z Karvinska a Českobudějovicka?
Popis metodiky:
Ze vzorků bukálních stěrů bude provedena izolace DNA, dále bude následovat amplifikace příslušného genu pomocí metody PCR. Poté budou vzorky osekvenovány. Následovat bude hodnocení sekvencí a klasifikace nalezených mutací. Předpokládá se vyšetření cca patnácti vzorků, hodnoceny budou ještě vzorky vyšetřené v předchozím období.
Předpokládané využití práce v praxi:
Bude ověřeno, že metodiku sekvenování z primárního vzorku bukálního stěru lze použít v klinikcké praxi. Výsledek by měl přispět ke vztahu výskytu mutací v závislosti na prostředí.
GARIBYAN, L. a AVASHIA, N., 2013. Polymerase Chain Reaction. The Journal of investigative dermatology [online]. 133(3), 1?4. doi: 10.1038/jid.2013.1. Dostupné z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/
HATINA, J. a SYKES, B. D., 1999. Lékařská genetika: problémy a přístupy. Praha: Academia. ISBN 80-200-0700-8.
HJEMQVIST, L., TUSON, M., MARFANY G., HERRERO, E., BALCELLS, S., GONZALEZ-DUARTE, R., 2002. ORMDL Proteins Are a Conserved New Family of Endoplasmic Reticulum Membrane Proteins [online]. 3(6). doi: 10.1186/gb-2002-3-6-research0027. Epub 2002 May 14. 4. Dostupné z: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12093374/
KUCIEL, J., URBAN, T., 2016. Principy genetiky. Brno: Mendelova univerzita v Brně. ISBN 978-80-7509-385-1.
SRŠEŇ, Š. a SRŠŇOVÁ,K.,2000. Základy klinickej genetiky a jej molekulárna podstata. Tretie, prepracované a rozšírené vydanie. Martin: Osveta. ISBN 80-8063-021-6.
GARIBYAN, L. a AVASHIA, N., 2013. Polymerase Chain Reaction. The Journal of investigative dermatology [online]. 133(3), 1?4. doi: 10.1038/jid.2013.1. Dostupné z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4102308/
HATINA, J. a SYKES, B. D., 1999. Lékařská genetika: problémy a přístupy. Praha: Academia. ISBN 80-200-0700-8.
HJEMQVIST, L., TUSON, M., MARFANY G., HERRERO, E., BALCELLS, S., GONZALEZ-DUARTE, R., 2002. ORMDL Proteins Are a Conserved New Family of Endoplasmic Reticulum Membrane Proteins [online]. 3(6). doi: 10.1186/gb-2002-3-6-research0027. Epub 2002 May 14. 4. Dostupné z: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12093374/
KUCIEL, J., URBAN, T., 2016. Principy genetiky. Brno: Mendelova univerzita v Brně. ISBN 978-80-7509-385-1.
SRŠEŇ, Š. a SRŠŇOVÁ,K.,2000. Základy klinickej genetiky a jej molekulárna podstata. Tretie, prepracované a rozšírené vydanie. Martin: Osveta. ISBN 80-8063-021-6.