Informace o kvalifikační práci Optimalizace pozitivních kontrol a určení
genotoxického potenciálu vzorku s použitím testu
reverzní mutace na bakteriích
Využití Amesova testu k určení mutagenního a tím i karcinogenního potenciálu
chemických látek, léčiv a zdravotnických prostředků je v současné době velmi oblíbené díky jeho jednoduchosti, rychlosti a finanční nenáročnosti provedení. Cílem této práce je statisticky zhodnotit historická data pozitivních a negativních kontrol získaných ve firmě MediTox s.r.o., dále pak na základě těchto dat navrhnout a provést optimalizaci pozitivních kontrol a poznatky z optimalizace ověřit a aplikovat v praxi na několika vzorcích. Na základě vyhodnocení historických dat firmy MediTox s.r.o. jsem usoudila, že je potřeba optimalizovat práci s E. coli. Bylo provedeno testování tří šarží pozitivních
kontrol v provedení bez S9 a dvou šarží v provedení s S9. Kontroly poskytly
konzistentní výsledky, na jejichž základě bylo možné vyhodnotit výsledky testu. Ze 3 testovaných vzorků vyplynulo, že je vhodné vyměnit E. coli Combo míchanou ve firmě MediTox s.r.o. ze dvou bakteriálních kmenů za dodanou a již připravenou směs těchto kmenů od firmy Xenometrix. Práci s ostatními kmeny a pozitivními kontrolami nebylo potřeba optimalizovat.
Anotace v angličtině
The use of the Ames test to determine the mutagenic and therefore carcinogenic
potential of chemicals is currently very popular due to its simplicity, speed and costeffectiveness. The aim of this work is to statistically evaluate the historical data of positive and negative controls obtained in the company MediTox s.r.o., based on this data, to design and execute the optimization of positive controls and to verify and apply the findings from the optimization in practice on several samples. Based on the evaluation of historical data of MediTox s.r.o. I concluded that it is necessary to optimize the work with E. coli. I performed the testing of three batches of positive controls, they were carried out without S9 and two batches were carried out with S9. According to the consistent results provided by the controls, it was possible to evaluate the results of the test. As emerged from three tested samples, it is appropriate to replace the E. coli Combo prepared from two bacteria strains by MediTox s.r.o. by a mixture of the above mentionned strains prepared by Xenometrix. It was not necessary to optimize the work with the other strains and positive controls.
Využití Amesova testu k určení mutagenního a tím i karcinogenního potenciálu
chemických látek, léčiv a zdravotnických prostředků je v současné době velmi oblíbené díky jeho jednoduchosti, rychlosti a finanční nenáročnosti provedení. Cílem této práce je statisticky zhodnotit historická data pozitivních a negativních kontrol získaných ve firmě MediTox s.r.o., dále pak na základě těchto dat navrhnout a provést optimalizaci pozitivních kontrol a poznatky z optimalizace ověřit a aplikovat v praxi na několika vzorcích. Na základě vyhodnocení historických dat firmy MediTox s.r.o. jsem usoudila, že je potřeba optimalizovat práci s E. coli. Bylo provedeno testování tří šarží pozitivních
kontrol v provedení bez S9 a dvou šarží v provedení s S9. Kontroly poskytly
konzistentní výsledky, na jejichž základě bylo možné vyhodnotit výsledky testu. Ze 3 testovaných vzorků vyplynulo, že je vhodné vyměnit E. coli Combo míchanou ve firmě MediTox s.r.o. ze dvou bakteriálních kmenů za dodanou a již připravenou směs těchto kmenů od firmy Xenometrix. Práci s ostatními kmeny a pozitivními kontrolami nebylo potřeba optimalizovat.
Anotace v angličtině
The use of the Ames test to determine the mutagenic and therefore carcinogenic
potential of chemicals is currently very popular due to its simplicity, speed and costeffectiveness. The aim of this work is to statistically evaluate the historical data of positive and negative controls obtained in the company MediTox s.r.o., based on this data, to design and execute the optimization of positive controls and to verify and apply the findings from the optimization in practice on several samples. Based on the evaluation of historical data of MediTox s.r.o. I concluded that it is necessary to optimize the work with E. coli. I performed the testing of three batches of positive controls, they were carried out without S9 and two batches were carried out with S9. According to the consistent results provided by the controls, it was possible to evaluate the results of the test. As emerged from three tested samples, it is appropriate to replace the E. coli Combo prepared from two bacteria strains by MediTox s.r.o. by a mixture of the above mentionned strains prepared by Xenometrix. It was not necessary to optimize the work with the other strains and positive controls.
V současné době je Ames test využíván celosvětově jako počáteční screening mutagenního potenciálu nových chemikálií a léčiv. Provádí se na několika kmenech Histidin dependentní (His-) Salmonella typhimurium a Tryptofan dependentní (Trp-) E. coli zbavených schopnosti syntetizovat dané aminokyseliny. Je vyžadován při registraci chemických látek jako test první volby. Pozitivní Ames test je dostatečný důkaz genotoxicity. Je to rychlá, levná in vitro metoda, s vysokou shodou predikce u hlodavčí karcinogenity.
2.Cíle práce:
Zkoušení a optimalizace pozitivní kontroly
Vytvoření tabulek historických dat pro pozitivní a negativní kontroly
Samostatné vyhodnocení genotoxicity vzorků
3. Metodika:
Během práce bude prováděn Ames test mikrofluktuační metodou na 4 kmenech Salmonelly a směsi dvou kmenů Escherichie coli. Bakterie budou vystaveny působení pozitivní a negativní kontroly, případně 6 koncentracím vzorku v přítomnosti i nepřítomnosti metabolické aktivace po 90 minut. Genotoxický účinek bude posuzován na základě vizuálního vyhodnocení pozitivních jamek (založeno na změně barvy použitého indikačního média z fialové na žlutou v závislosti na změně pH). Všechna data budou vyhodnocena v Excel Calculation Sheet (Calculation sheets for Ames II and Ames MPF, Xenometrics)
4. Výzkumný soubor:
Vzorky pozitivních kontrol 4-NQO, 2-AF, vzorky negativních kontrol Aqua pro injection, DMSO, 2 testované látky (1x v roztoku, 1 x výluh)
5.Přínos:
Vytvoření souboru chybějících historických dat, porovnání různých způsobů testování a jejich vliv na správnou funkci pozitivních kontrol. Spolupráce na testování vzorků v režimu SLP.
Zásady pro vypracování
1. Současný stav:
V současné době je Ames test využíván celosvětově jako počáteční screening mutagenního potenciálu nových chemikálií a léčiv. Provádí se na několika kmenech Histidin dependentní (His-) Salmonella typhimurium a Tryptofan dependentní (Trp-) E. coli zbavených schopnosti syntetizovat dané aminokyseliny. Je vyžadován při registraci chemických látek jako test první volby. Pozitivní Ames test je dostatečný důkaz genotoxicity. Je to rychlá, levná in vitro metoda, s vysokou shodou predikce u hlodavčí karcinogenity.
2.Cíle práce:
Zkoušení a optimalizace pozitivní kontroly
Vytvoření tabulek historických dat pro pozitivní a negativní kontroly
Samostatné vyhodnocení genotoxicity vzorků
3. Metodika:
Během práce bude prováděn Ames test mikrofluktuační metodou na 4 kmenech Salmonelly a směsi dvou kmenů Escherichie coli. Bakterie budou vystaveny působení pozitivní a negativní kontroly, případně 6 koncentracím vzorku v přítomnosti i nepřítomnosti metabolické aktivace po 90 minut. Genotoxický účinek bude posuzován na základě vizuálního vyhodnocení pozitivních jamek (založeno na změně barvy použitého indikačního média z fialové na žlutou v závislosti na změně pH). Všechna data budou vyhodnocena v Excel Calculation Sheet (Calculation sheets for Ames II and Ames MPF, Xenometrics)
4. Výzkumný soubor:
Vzorky pozitivních kontrol 4-NQO, 2-AF, vzorky negativních kontrol Aqua pro injection, DMSO, 2 testované látky (1x v roztoku, 1 x výluh)
5.Přínos:
Vytvoření souboru chybějících historických dat, porovnání různých způsobů testování a jejich vliv na správnou funkci pozitivních kontrol. Spolupráce na testování vzorků v režimu SLP.
Seznam doporučené literatury
1) FLÜCKIGER-ISLER S., KAMBER M., 2012. Direct comparison of the Ames microplate format (MPF) test in liquid medium with the standard Ames pre-incubation assay on agar plates by use of equivocal to weakly positive test compounds. Mutation Research. 747(1), 36-45, doi: 10.1016/j.mrgentox.2012.03.014
2) OECD (1997), Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264071247-en.
4) FLÜCKIGER-ISLER S., KAMBER M., ENGELHARD G., JAECKH R., ZEIGER E., 2009. Comparison of the Ames II and traditional Ames test responses with respect to mutagenicity, strain specificities, eed for metabolism aqnd correlation with rodent carcinogenicity. Mutagenesis 24(4), 359-366. doi: 10.1093/mutage/gep017
5) MORTELMANS K., ZIEGLER E., 2000, The Ames Salmonella / microsome mutagenicity assay. Mutation research 455(1-2), 29-60. doi.org/10.1016/S0027-5107(00)00064-6
Seznam doporučené literatury
1) FLÜCKIGER-ISLER S., KAMBER M., 2012. Direct comparison of the Ames microplate format (MPF) test in liquid medium with the standard Ames pre-incubation assay on agar plates by use of equivocal to weakly positive test compounds. Mutation Research. 747(1), 36-45, doi: 10.1016/j.mrgentox.2012.03.014
2) OECD (1997), Test No. 471: Bacterial Reverse Mutation Test, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris, https://doi.org/10.1787/9789264071247-en.
4) FLÜCKIGER-ISLER S., KAMBER M., ENGELHARD G., JAECKH R., ZEIGER E., 2009. Comparison of the Ames II and traditional Ames test responses with respect to mutagenicity, strain specificities, eed for metabolism aqnd correlation with rodent carcinogenicity. Mutagenesis 24(4), 359-366. doi: 10.1093/mutage/gep017
5) MORTELMANS K., ZIEGLER E., 2000, The Ames Salmonella / microsome mutagenicity assay. Mutation research 455(1-2), 29-60. doi.org/10.1016/S0027-5107(00)00064-6