Kryoprezervace a transplantace zárodečných buněk u ryb poskytuje vhodný nástroj pro zachování genetické informace. Metodou náhradních rodičů lze získat potomstvo se znaky zvoleného donora, v tomto případě komerčně důležitého, kapra obecného. Pro úspěšnou kryoprezervaci zárodečných buněk ryb ale musí být stanovený vhodný protokol individuálně pro každý druh. V případě této práce se testovalo několik kryoprotektantů. U nejlepšího z nich, Me2SO, co se životaschopnosti spermatogonií týče, se testovaly jeho různé koncentrace v závislosti na rychlosti zamrazování. Dále následovalo testování vlivu velikosti zamrazované tkáně, inkubačního času a přidaného cukru. Výsledkem testování bylo kryomédium sestávající se z 2,5M dimethylsulfoxidu, přidaného cukru 0,3M glukózy, 1,5% BSA a 25nM Hepes rozpuštěného v PBS. Jako nejvhodnější byla stanovena velikost zamrazované tkáně 100 mg, inkubační čas 30 min a rychlost zamrazování -1 °C/min. Tento výsledek zajišťuje nejvyšší míru přežití kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného a nabízí optimální podmínky pro jejich zamrazování. Druhou částí práce bylo ověření úspěšnosti transplantace kryoprezervovaných a i čerstvých spermatogonií do vhodně zvoleného recipienta, jímž je karas zlatý, který s kaprem obecným sdílí obdobné reprodukční charakteristiky, ale zároveň nabízí i snížení nároků na prostor, nebo odolnost vůči koi-herpes viru. Transplantované zárodečné buňky kolonizovaly zárodečnou rýhu a spustily gametogenezi celkem u 42,5 % (kryoprezervované spermatogonie) a 52,5 % (čerstvé spermatogonie) recipientů karase zlatého, což prokázalo, že transplantace kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného, do recipienta karase zlatého, je úspěšně realizovatelná.
Anotace v angličtině
Cryopreservation and transplantation of germ cells in fish provides a suitable tool for preserving genetic information. By method of surrogate reproduction, the offspring with characters of the chosen donor can be obtained. In this case of our commercially important species common carp. However, for the successful cryopreservation of the germ cells, a suitable protocol for each species must be established. Several cryoprotectants were tested. The best of them, Me2SO, regarding the viability of spermatogonia, was tested for its different concentrations depending also on the rate of freezing. Further testing, related to the effect of tissue size, incubation time and added sugar, was performed. The result of the assay identified best cryomedium composed of 2.5M dimethylsulfoxide, added sugar of 0.3M glucose, 1.5% BSA and 25nM Hepes dissolved in PBS. The most suitable size of tissue was 100 mg, incubation time was 30 min and coolig rate was -1 ° C/min. This protocol ensures the highest viability rate of cryopreserved spermatogonia of common carp. The second part of the work was to verify the success of the transplantation of cryopreserved and fresh spermatogonia into a suitably chosen recipient, the goldfish, which shares similar reproductive characteristics with carp, but also offers reduction of space requirements or resistance to koi-herpes virus. The transplanted germ cells colonized the germ line and started gametogenesis in 42.5% (cryopreserved spermatogonia) and 52.5% (fresh spermatogonia) goldfish recipients, which demonstrated that the transplantation of cryopreserved spermatogonia of common carp can be successfully achieved.
germ cells, transplantation, cryopreservation, spermatogonia, common carp, recipient, donor
Rozsah průvodní práce
59
Jazyk
CZ
Anotace
Kryoprezervace a transplantace zárodečných buněk u ryb poskytuje vhodný nástroj pro zachování genetické informace. Metodou náhradních rodičů lze získat potomstvo se znaky zvoleného donora, v tomto případě komerčně důležitého, kapra obecného. Pro úspěšnou kryoprezervaci zárodečných buněk ryb ale musí být stanovený vhodný protokol individuálně pro každý druh. V případě této práce se testovalo několik kryoprotektantů. U nejlepšího z nich, Me2SO, co se životaschopnosti spermatogonií týče, se testovaly jeho různé koncentrace v závislosti na rychlosti zamrazování. Dále následovalo testování vlivu velikosti zamrazované tkáně, inkubačního času a přidaného cukru. Výsledkem testování bylo kryomédium sestávající se z 2,5M dimethylsulfoxidu, přidaného cukru 0,3M glukózy, 1,5% BSA a 25nM Hepes rozpuštěného v PBS. Jako nejvhodnější byla stanovena velikost zamrazované tkáně 100 mg, inkubační čas 30 min a rychlost zamrazování -1 °C/min. Tento výsledek zajišťuje nejvyšší míru přežití kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného a nabízí optimální podmínky pro jejich zamrazování. Druhou částí práce bylo ověření úspěšnosti transplantace kryoprezervovaných a i čerstvých spermatogonií do vhodně zvoleného recipienta, jímž je karas zlatý, který s kaprem obecným sdílí obdobné reprodukční charakteristiky, ale zároveň nabízí i snížení nároků na prostor, nebo odolnost vůči koi-herpes viru. Transplantované zárodečné buňky kolonizovaly zárodečnou rýhu a spustily gametogenezi celkem u 42,5 % (kryoprezervované spermatogonie) a 52,5 % (čerstvé spermatogonie) recipientů karase zlatého, což prokázalo, že transplantace kryoprezervovaných spermatogonií kapra obecného, do recipienta karase zlatého, je úspěšně realizovatelná.
Anotace v angličtině
Cryopreservation and transplantation of germ cells in fish provides a suitable tool for preserving genetic information. By method of surrogate reproduction, the offspring with characters of the chosen donor can be obtained. In this case of our commercially important species common carp. However, for the successful cryopreservation of the germ cells, a suitable protocol for each species must be established. Several cryoprotectants were tested. The best of them, Me2SO, regarding the viability of spermatogonia, was tested for its different concentrations depending also on the rate of freezing. Further testing, related to the effect of tissue size, incubation time and added sugar, was performed. The result of the assay identified best cryomedium composed of 2.5M dimethylsulfoxide, added sugar of 0.3M glucose, 1.5% BSA and 25nM Hepes dissolved in PBS. The most suitable size of tissue was 100 mg, incubation time was 30 min and coolig rate was -1 ° C/min. This protocol ensures the highest viability rate of cryopreserved spermatogonia of common carp. The second part of the work was to verify the success of the transplantation of cryopreserved and fresh spermatogonia into a suitably chosen recipient, the goldfish, which shares similar reproductive characteristics with carp, but also offers reduction of space requirements or resistance to koi-herpes virus. The transplanted germ cells colonized the germ line and started gametogenesis in 42.5% (cryopreserved spermatogonia) and 52.5% (fresh spermatogonia) goldfish recipients, which demonstrated that the transplantation of cryopreserved spermatogonia of common carp can be successfully achieved.
germ cells, transplantation, cryopreservation, spermatogonia, common carp, recipient, donor
Zásady pro vypracování
Bylo prokázáno, že lze využít potenciálu zárodečných kmenových buněk pro indukci chimér zárodečné linie prostřednictvím jejich transplantace do organismu recipienta, ve kterém jsou tyto buňky schopny proliferovat a následně produkovat gamety donora. Pravděpodobně nejefektivnějším způsobem pro generaci chimér je transplantace spermatogonií do larev recipientů. Tato technologie byla zatím aplikována pouze u několika druhů ryb, což dává značný prostor pro rozšíření informací o možnostech náhradní reprodukce, která by v budoucnu mohla být aplikována ve větším měřítku. Získání zárodečných buněk pro transplantaci se bohužel neobejde bez usmrcení jedince, kdy je obvykle získáno velké množství testikulární tkáně obsahující spermatogonie. Pro samotnou transplantaci obvykle postačí velmi malý zlomek z celkového množství tkáně. Nevyužitá část může být efektivně uchována prostřednictvím kryokonzervace a následně v budoucnosti použita pro další transplantace. Tímto postupem lze dlouhodobě uchovat nejen paternální genetickou informaci, jak je tomu v případě kryoprezervace spermií, ale také maternální genetickou informaci (např. mDNA), kterou jinými způsoby u ryb dlouhodobě uchovat nelze.
Cílem diplomové práce bude vytvořit nejvhodnější protokol pro zamrazování spermatogonií našeho komerčně důležitého druhu ryby, kapra obecného, a následně ověřit možnost produkce kapřích gamet prostřednictvím transplantace spermatogonií do náhradních rodičů karase zlatého.
Metodický postup se bude skládat z testování různých kryoprotektantů o několika koncentracích při různých rychlostech mrazení na přežití spermatogonií. Pro účely transplantace budou jikry karase zlatého mikroinjikovány morpholinem, které blokuje translaci dead end genu, čímž dojde k jejich sterilizaci. Do recipientů ve věku 2 týdnů budou intraperitonálně transplantovány kryoprezervované spermatogonie. Recipienti budou odchováni do pohlavní dospělosti s cílem získat a identifikovat gamety/potomstvo donora.
Zásady pro vypracování
Bylo prokázáno, že lze využít potenciálu zárodečných kmenových buněk pro indukci chimér zárodečné linie prostřednictvím jejich transplantace do organismu recipienta, ve kterém jsou tyto buňky schopny proliferovat a následně produkovat gamety donora. Pravděpodobně nejefektivnějším způsobem pro generaci chimér je transplantace spermatogonií do larev recipientů. Tato technologie byla zatím aplikována pouze u několika druhů ryb, což dává značný prostor pro rozšíření informací o možnostech náhradní reprodukce, která by v budoucnu mohla být aplikována ve větším měřítku. Získání zárodečných buněk pro transplantaci se bohužel neobejde bez usmrcení jedince, kdy je obvykle získáno velké množství testikulární tkáně obsahující spermatogonie. Pro samotnou transplantaci obvykle postačí velmi malý zlomek z celkového množství tkáně. Nevyužitá část může být efektivně uchována prostřednictvím kryokonzervace a následně v budoucnosti použita pro další transplantace. Tímto postupem lze dlouhodobě uchovat nejen paternální genetickou informaci, jak je tomu v případě kryoprezervace spermií, ale také maternální genetickou informaci (např. mDNA), kterou jinými způsoby u ryb dlouhodobě uchovat nelze.
Cílem diplomové práce bude vytvořit nejvhodnější protokol pro zamrazování spermatogonií našeho komerčně důležitého druhu ryby, kapra obecného, a následně ověřit možnost produkce kapřích gamet prostřednictvím transplantace spermatogonií do náhradních rodičů karase zlatého.
Metodický postup se bude skládat z testování různých kryoprotektantů o několika koncentracích při různých rychlostech mrazení na přežití spermatogonií. Pro účely transplantace budou jikry karase zlatého mikroinjikovány morpholinem, které blokuje translaci dead end genu, čímž dojde k jejich sterilizaci. Do recipientů ve věku 2 týdnů budou intraperitonálně transplantovány kryoprezervované spermatogonie. Recipienti budou odchováni do pohlavní dospělosti s cílem získat a identifikovat gamety/potomstvo donora.
Seznam doporučené literatury
Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G., 2013. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 1640-1645. doi:10.1073/pnas.1218468110
Lee, S., Yoshizaki, G., 2016. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology 72, 165-168. doi:10.1016/j.cryobiol.2016.01.004
Marinović, Z., Lujić, J., Kása, E., Bernáth, G., Urbányi, B., Horváth, Á., 2016. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. doi:10.1016/j.ygcen.2016.07.005
Okutsu, T., Shikina, S., Sakamoto, T., Mochizuki, M., Yoshizaki, G., 2015. Successful production of functional Y eggs derived from spermatogonia transplanted into female recipients and subsequent production of YY supermales in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 446, 298-302. doi:10.1016/j.aquaculture.2015.05.020
Okutsu, T., Suzuki, K., Takeuchi, Y., Takeuchi, T., Yoshizaki, G., 2006a. Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 2725-2729. doi:10.1073/pnas.0509218103
Okutsu, T., Yano, A., Nagasawa, K., Shikina, S., Kobayashi, T., Takeuchi, Y., Yoshizaki, G., 2006b. Manipulation of fish germ cell: visualization, cryopreservation and transplantation. J. Reprod. Dev. 52, 685-693. doi:10.1262/jrd.18096
Pšenička, M., Saito, T., Linhartová, Z., Gazo, I., 2015. Isolation and transplantation of sturgeon early-stage germ cells. Theriogenology 83, 1085-1092. doi:10.1016/j.theriogenology.2014.12.010
Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B., 2016. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology 72 (2), 119-122.
Robles, V., Riesco, M.F., Psenicka, M., Saito, T., Valcarce, D.G., Cabrita, E., Herráez, P., 2015. Biology of teleost primordial germ cells (PGCs) and spermatogonia: Biotechnological applications. Aquaculture. doi:10.1016/j.aquaculture.2016.03.004
Takeuchi, Y., 2003. Generation of Live Fry from Intraperitoneally Transplanted Primordial Germ Cells in Rainbow Trout. Biol. Reprod. 69, 1142-1149. doi:10.1095/biolreprod.103.017624
Yamaha, E., Saito, T., Goto-Kazeto, R., Arai, K., 2007. Developmental biotechnology for aquaculture, with special reference to surrogate production in teleost fishes. J. Sea Res. 58, 8-22. doi:10.1016/j.seares.2007.02.003
Seznam doporučené literatury
Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G., 2013. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 1640-1645. doi:10.1073/pnas.1218468110
Lee, S., Yoshizaki, G., 2016. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology 72, 165-168. doi:10.1016/j.cryobiol.2016.01.004
Marinović, Z., Lujić, J., Kása, E., Bernáth, G., Urbányi, B., Horváth, Á., 2016. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. doi:10.1016/j.ygcen.2016.07.005
Okutsu, T., Shikina, S., Sakamoto, T., Mochizuki, M., Yoshizaki, G., 2015. Successful production of functional Y eggs derived from spermatogonia transplanted into female recipients and subsequent production of YY supermales in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 446, 298-302. doi:10.1016/j.aquaculture.2015.05.020
Okutsu, T., Suzuki, K., Takeuchi, Y., Takeuchi, T., Yoshizaki, G., 2006a. Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 2725-2729. doi:10.1073/pnas.0509218103
Okutsu, T., Yano, A., Nagasawa, K., Shikina, S., Kobayashi, T., Takeuchi, Y., Yoshizaki, G., 2006b. Manipulation of fish germ cell: visualization, cryopreservation and transplantation. J. Reprod. Dev. 52, 685-693. doi:10.1262/jrd.18096
Pšenička, M., Saito, T., Linhartová, Z., Gazo, I., 2015. Isolation and transplantation of sturgeon early-stage germ cells. Theriogenology 83, 1085-1092. doi:10.1016/j.theriogenology.2014.12.010
Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B., 2016. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology 72 (2), 119-122.
Robles, V., Riesco, M.F., Psenicka, M., Saito, T., Valcarce, D.G., Cabrita, E., Herráez, P., 2015. Biology of teleost primordial germ cells (PGCs) and spermatogonia: Biotechnological applications. Aquaculture. doi:10.1016/j.aquaculture.2016.03.004
Takeuchi, Y., 2003. Generation of Live Fry from Intraperitoneally Transplanted Primordial Germ Cells in Rainbow Trout. Biol. Reprod. 69, 1142-1149. doi:10.1095/biolreprod.103.017624
Yamaha, E., Saito, T., Goto-Kazeto, R., Arai, K., 2007. Developmental biotechnology for aquaculture, with special reference to surrogate production in teleost fishes. J. Sea Res. 58, 8-22. doi:10.1016/j.seares.2007.02.003
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
ilustrace, grafy, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Studentka Bc. Michaela Fučíková seznámila komisi se svou diplomovou prací.
Tajemník komise, doc. Ing. Jan Mráz, Ph.D., seznámil komisi s posudkem vedoucího a oponenta diplomové práce. Následně studentka zodpověděla doplňující otázky.
Proběhla diskuze na téma práce. Studentka adekvátně a správně reagovala na vznesené dotazy členů komise. Komise se při hodnocení vlastní práce ztotožnila s návrhy posuzovatelů práce (vedoucího a oponenta) a dohodla se na výsledku obhajoby níže. Komise shledala práci dostatečně inovativní pro udělení prémiového stipendia.