Cílem práce bylo detekovat (anti-)progestagenní aktivitu ve vzorcích vody z přítoku a odtoku šesti čistíren odpadních vod (ČOV) nacházejících se v jihočeském kraji. Následně byla posouzena účinnost procesu čištění daných ČOV z tohoto hlediska. Odebraná odpadní voda byla převezena do laboratoře a extrahována technikou extrakce na pevné fázi. Zachycené látky byly promyty, odpařeny a rozpuštěny v DMSO. Vlastní detekce (anti-)progestagenní aktivity byla provedena za pomoci PR-CALUX in vitro biotestu. Buňky byly nasazeny na mikrotitrační destičku a po inkubaci byly vystaveny referenční látce ORG2058 v případě detekce progestagenní aktivity či referenční látce RU-486 pro detekci aktivity antiprogestagenní a také řadě ředěných extraktů odpadní vody. Poté byla měřena luminiscence buněk, která byla vyjádřena v relativních světelných jednotkách a představovala měřítko pro (anti-)progestagenní aktivitu.(Anti-)progestagenní aktivita byla udávána v ekvivalentních koncentracích vztahujících se k referenční látce Progestagenní aktivita se na přítoku ČOV pohybovala v koncentracích pod LOQ až po 1,8 ng/l ORG2058 eq. Na odtoku byla tato aktivita naměřena v koncentracích pod LOQ až po 0,5 ng/l ORG2058 eq. Míra odstranění progestagenní aktivity se pohybovala v rozmezí od -25 % do 100 %. Antiprogestagenní aktivita se na přítoku ČOV pohybovala v koncentracích pod LOQ až po 1 ng/l RU-486 eq. Na odtoku byla tato aktivita naměřena v koncentracích pod LOQ až po 9,7 ng/l RU-486 eq. Míra odstranění antiprogestagenní aktivity se pohybovala v rozmezí od -50 % do 100 %. Za pomoci PR-CALUX in vitro biotestu byla prokázána (anti-)progestagenní aktivita v odpadních vodách. Zároveň byla prokázána záporná účinnost čištění na některých ČOV, která by mohla být způsobena pravděpodobně biotransformací některých látek, které nemají (anti-)progestagenní aktivitu, na látky, které tuto aktivitu naopak vykazují nebo dekonjugací metabolitů účinných látek s (anti-)progestagenní aktivitou. Antiprogestagenní aktivita by se mohla jevit, z důvodu koncentrací na odtoku z ČOV, jako rizikovější pro organismy žijící ve vodním prostředí než aktivita progestagenní. Avšak ani tato aktivita by neměla být podceňována.
Anotace v angličtině
The aim of this diploma thesis was to detect (anti-)progestagenic activity in wastewater samples from the influent and effluent of six wastewater treatment plants (WWTPs) located in South Bohemia. Subsequently, the efficiency of the treatment process of this WWTPs was assessed from this point of view.
The wastewater from WWTPs was transported to the laboratory and extracted oby solid phase extraction. The eluates were washed, evaporated and dissolved in DMSO. Detection of (anti-)progestagenic activity was performed by using the PR-CALUX in vitro bioassay. Transgenic cells were seeded on well plates and were exposed to ORG2058, reference substance for progestagenic activity, or RU-486, reference substance for antiprogestagenic activity, as well as a number of diluted wastewater extracts. After that, luminiscence of the cells was measured and it was was expressed in relative light units which were a measure of (anti-)progestagenic activity.(Anti-)progestagenic activity was reported in equivalent concentrations of the reference substance. Progestagenic activity in WWTPs influent ranged from below LOQ up to 1.8 ng/l ORG2058 eq. In effluent this activity ranged from below LOQ up to 0.5 ng/l ORG2058 eq. The elimination rate of progestagenic activity ranged from -25% to 100%. Antiprogestagenic activity in WWTPs inffluent was below the LOQ up to 1 ng/l RU-486 eq. In effluent this activity was below LOQ up to 9.7 ng/l RU-486 eq. The elimination rate of antiprogestagenic activity ranged from -50% to 100%.(Anti-)progestagenic activity in waste water has been demonstrated by using the PR-CALUX in vitro bioassay. Negative removal efficiency of some WWTPs was also documented. This is probably caused by biotransformation of some substances which don´t have (anti-)progestagenic activity to substances which have this activity or it is caused by deconjugation of metabolits of compounds with (anti-)progestagenic activity. Antiprogestagenic activity may be more hazardous for organisms living in the aquatic environment than progestagenic activity because of concentrations in WWTPs effluent. However this activity should not be underestimated.
Klíčová slova
antiprogestagenní látky, CALUX, ČOV, in vitro, koncentrace, LOQ, progesteron, progestagenní látky
Cílem práce bylo detekovat (anti-)progestagenní aktivitu ve vzorcích vody z přítoku a odtoku šesti čistíren odpadních vod (ČOV) nacházejících se v jihočeském kraji. Následně byla posouzena účinnost procesu čištění daných ČOV z tohoto hlediska. Odebraná odpadní voda byla převezena do laboratoře a extrahována technikou extrakce na pevné fázi. Zachycené látky byly promyty, odpařeny a rozpuštěny v DMSO. Vlastní detekce (anti-)progestagenní aktivity byla provedena za pomoci PR-CALUX in vitro biotestu. Buňky byly nasazeny na mikrotitrační destičku a po inkubaci byly vystaveny referenční látce ORG2058 v případě detekce progestagenní aktivity či referenční látce RU-486 pro detekci aktivity antiprogestagenní a také řadě ředěných extraktů odpadní vody. Poté byla měřena luminiscence buněk, která byla vyjádřena v relativních světelných jednotkách a představovala měřítko pro (anti-)progestagenní aktivitu.(Anti-)progestagenní aktivita byla udávána v ekvivalentních koncentracích vztahujících se k referenční látce Progestagenní aktivita se na přítoku ČOV pohybovala v koncentracích pod LOQ až po 1,8 ng/l ORG2058 eq. Na odtoku byla tato aktivita naměřena v koncentracích pod LOQ až po 0,5 ng/l ORG2058 eq. Míra odstranění progestagenní aktivity se pohybovala v rozmezí od -25 % do 100 %. Antiprogestagenní aktivita se na přítoku ČOV pohybovala v koncentracích pod LOQ až po 1 ng/l RU-486 eq. Na odtoku byla tato aktivita naměřena v koncentracích pod LOQ až po 9,7 ng/l RU-486 eq. Míra odstranění antiprogestagenní aktivity se pohybovala v rozmezí od -50 % do 100 %. Za pomoci PR-CALUX in vitro biotestu byla prokázána (anti-)progestagenní aktivita v odpadních vodách. Zároveň byla prokázána záporná účinnost čištění na některých ČOV, která by mohla být způsobena pravděpodobně biotransformací některých látek, které nemají (anti-)progestagenní aktivitu, na látky, které tuto aktivitu naopak vykazují nebo dekonjugací metabolitů účinných látek s (anti-)progestagenní aktivitou. Antiprogestagenní aktivita by se mohla jevit, z důvodu koncentrací na odtoku z ČOV, jako rizikovější pro organismy žijící ve vodním prostředí než aktivita progestagenní. Avšak ani tato aktivita by neměla být podceňována.
Anotace v angličtině
The aim of this diploma thesis was to detect (anti-)progestagenic activity in wastewater samples from the influent and effluent of six wastewater treatment plants (WWTPs) located in South Bohemia. Subsequently, the efficiency of the treatment process of this WWTPs was assessed from this point of view.
The wastewater from WWTPs was transported to the laboratory and extracted oby solid phase extraction. The eluates were washed, evaporated and dissolved in DMSO. Detection of (anti-)progestagenic activity was performed by using the PR-CALUX in vitro bioassay. Transgenic cells were seeded on well plates and were exposed to ORG2058, reference substance for progestagenic activity, or RU-486, reference substance for antiprogestagenic activity, as well as a number of diluted wastewater extracts. After that, luminiscence of the cells was measured and it was was expressed in relative light units which were a measure of (anti-)progestagenic activity.(Anti-)progestagenic activity was reported in equivalent concentrations of the reference substance. Progestagenic activity in WWTPs influent ranged from below LOQ up to 1.8 ng/l ORG2058 eq. In effluent this activity ranged from below LOQ up to 0.5 ng/l ORG2058 eq. The elimination rate of progestagenic activity ranged from -25% to 100%. Antiprogestagenic activity in WWTPs inffluent was below the LOQ up to 1 ng/l RU-486 eq. In effluent this activity was below LOQ up to 9.7 ng/l RU-486 eq. The elimination rate of antiprogestagenic activity ranged from -50% to 100%.(Anti-)progestagenic activity in waste water has been demonstrated by using the PR-CALUX in vitro bioassay. Negative removal efficiency of some WWTPs was also documented. This is probably caused by biotransformation of some substances which don´t have (anti-)progestagenic activity to substances which have this activity or it is caused by deconjugation of metabolits of compounds with (anti-)progestagenic activity. Antiprogestagenic activity may be more hazardous for organisms living in the aquatic environment than progestagenic activity because of concentrations in WWTPs effluent. However this activity should not be underestimated.
Klíčová slova
antiprogestagenní látky, CALUX, ČOV, in vitro, koncentrace, LOQ, progesteron, progestagenní látky
Syntetické progestiny jsou látky, které vykazují stejně jako ženský hormon progesteron progestagenní aktivitu, a proto mají potenciál negativně ovlivňovat endokrinní systém exponovaných organizmů. V důsledku velké spotřeby léčiv s obsahem syntetických progestinů se předpokládá, že právě tyto látky jsou hlavními přispěvateli k progestagenní aktivitě odpadních i některých povrchových vod. Navzdory tomu jsou doposud v dostupné literatuře pouze kusé informace o tom, do jaké míry ovlivní proces čištění na čistírnách odpadních vod (ČOV) progestagenní aktivitu odpadních vod. V relativně velkém množství jsou v léčivech konzumovány také anti-progestiny a selektivní modulátory progesteronového receptoru. Tyto látky mají (anti)-progestagenní aktivitu, tedy schopnost blokovat progesteronový receptor, což může rovněž vést k endokrinním poruchám.
Cílem diplomové práce bude detekovat (anti-)progestagenní aktivity in vitro pomocí buněčné linie PR-CALUX ve vzorcích odpadních vod odebraných z přítoku a odtoku z několika ČOV a na základě získaných výsledků posoudit účinnost procesu čištění daných ČOV z tohoto hlediska.
Metodický postup: Odpadní voda bude odebrána pomocí kompozitního vzorkovače nebo tam, kde to nebude možné, bodovým odběrem z přítoku a odtoku několika městských ČOV. Vzorky odpadních vod budou extrahovány technikou extrakce na pevné fázi (SPE - solid phase extraction). S extrakty pak budou prováděny PR-CALUX in vitro biotesty pro zjištění (anti-)progestagenní aktivity. Jako referenční látka pro progestagenní aktivitu bude použit syntetický progestin ORG 2058 a pro anti-progestagenní aktivitu syntetický anti-progestin mifepriston (RU-486). Získaná data budou statisticky vyhodnocena pomocí nelineární regrese. Následně bude posouzena účinnost ČOV eliminovat látky vykazující (anti-)progestagenní aktivitu. Extrakty OV budou otestovány na cytotoxicitu pomocí testu redukce resazurinu, aby byl vyloučen toxický vliv extraktů na životnost buněk.
Zásady pro vypracování
Syntetické progestiny jsou látky, které vykazují stejně jako ženský hormon progesteron progestagenní aktivitu, a proto mají potenciál negativně ovlivňovat endokrinní systém exponovaných organizmů. V důsledku velké spotřeby léčiv s obsahem syntetických progestinů se předpokládá, že právě tyto látky jsou hlavními přispěvateli k progestagenní aktivitě odpadních i některých povrchových vod. Navzdory tomu jsou doposud v dostupné literatuře pouze kusé informace o tom, do jaké míry ovlivní proces čištění na čistírnách odpadních vod (ČOV) progestagenní aktivitu odpadních vod. V relativně velkém množství jsou v léčivech konzumovány také anti-progestiny a selektivní modulátory progesteronového receptoru. Tyto látky mají (anti)-progestagenní aktivitu, tedy schopnost blokovat progesteronový receptor, což může rovněž vést k endokrinním poruchám.
Cílem diplomové práce bude detekovat (anti-)progestagenní aktivity in vitro pomocí buněčné linie PR-CALUX ve vzorcích odpadních vod odebraných z přítoku a odtoku z několika ČOV a na základě získaných výsledků posoudit účinnost procesu čištění daných ČOV z tohoto hlediska.
Metodický postup: Odpadní voda bude odebrána pomocí kompozitního vzorkovače nebo tam, kde to nebude možné, bodovým odběrem z přítoku a odtoku několika městských ČOV. Vzorky odpadních vod budou extrahovány technikou extrakce na pevné fázi (SPE - solid phase extraction). S extrakty pak budou prováděny PR-CALUX in vitro biotesty pro zjištění (anti-)progestagenní aktivity. Jako referenční látka pro progestagenní aktivitu bude použit syntetický progestin ORG 2058 a pro anti-progestagenní aktivitu syntetický anti-progestin mifepriston (RU-486). Získaná data budou statisticky vyhodnocena pomocí nelineární regrese. Následně bude posouzena účinnost ČOV eliminovat látky vykazující (anti-)progestagenní aktivitu. Extrakty OV budou otestovány na cytotoxicitu pomocí testu redukce resazurinu, aby byl vyloučen toxický vliv extraktů na životnost buněk.
Seznam doporučené literatury
Africander, D., Verhoog, N., & Hapgood, J. P., 2011. Molecular mechanisms of steroid receptor-mediated actions by synthetic progestins used in HRT and contraception. Steroids, 76(7), 636-652.
Bain, P. A., Williams, M., & Kumar, A., 2014. Assessment of multiple hormonal activities in wastewater at different stages of treatment. Environmental Toxicology and Chemistry, 33(10), 2297-2307.
Besse, J. P., & Garric, J., 2009. Progestagens for human use, exposure and hazard assessment for the aquatic environment. Environmental Pollution, 157(12), 3485-3494.
Kumar, V., Johnson, A. C., Trubiroha, A., Tumová, J., Ihara, M., Grabic, R., Kloas W., Tanaka H., & Kroupová, H. K., 2015. The challenge presented by progestins in ecotoxicological research: a critical review. Environmental Science & Technology, 49(5), 2625-2638.
Leusch, F. D., Khan, S. J., Laingam, S., Prochazka, E., Froscio, S., Trinh, T., Chapman H. F., & Humpage, A., 2014. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Research, 49, 300-315.
O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T. & Pognan, F., 2000. Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry, 267, 5421-5426.
Philibert, D., Bouchoux, F., Degryse, M., Lecaque, D., Petit, F., & Gaillard, M., 1999. The pharmacological profile of a novel norpregnane progestin (trimegestone). Gynecological Endocrinology, 13(5), 316-326.
Schriks, M., Heringa, M. B., & van der Linden, S. C., 2009. Temporal variation in multiple hormonal activities of surface waters located in the Dutch part of the Rhine basin. Association of Rhine Waterworks - RIWA, The Netherlands, pp. 24.
Sonneveld, E., Pieterse, B., Schoonen, W. G., & van der Burg, B., 2011. Validation of in vitro screening models for progestagenic activities: inter-assay comparison and correlation with in vivo activity in rabbits. Toxicology in Vitro, 25(2), 545-554.
Van der Linden, S. C., Heringa, M. B., Man, H. Y., Sonneveld, E., Puijker, L. M., Brouwer, A., & Van der Burg, B., 2008. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environmental Science & Technology, 42(15), 5814-5820.
Viswanath, G., Halder, S., Divya, G., Majumder, C. B., & Roy, P., 2008. Detection of potential (anti)-progestagenic endocrine disruptors using a recombinant human progesterone receptor binding and transactivation assay. Molecular and Cellular Endocrinology, 295(1), 1-9.
Seznam doporučené literatury
Africander, D., Verhoog, N., & Hapgood, J. P., 2011. Molecular mechanisms of steroid receptor-mediated actions by synthetic progestins used in HRT and contraception. Steroids, 76(7), 636-652.
Bain, P. A., Williams, M., & Kumar, A., 2014. Assessment of multiple hormonal activities in wastewater at different stages of treatment. Environmental Toxicology and Chemistry, 33(10), 2297-2307.
Besse, J. P., & Garric, J., 2009. Progestagens for human use, exposure and hazard assessment for the aquatic environment. Environmental Pollution, 157(12), 3485-3494.
Kumar, V., Johnson, A. C., Trubiroha, A., Tumová, J., Ihara, M., Grabic, R., Kloas W., Tanaka H., & Kroupová, H. K., 2015. The challenge presented by progestins in ecotoxicological research: a critical review. Environmental Science & Technology, 49(5), 2625-2638.
Leusch, F. D., Khan, S. J., Laingam, S., Prochazka, E., Froscio, S., Trinh, T., Chapman H. F., & Humpage, A., 2014. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Research, 49, 300-315.
O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T. & Pognan, F., 2000. Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry, 267, 5421-5426.
Philibert, D., Bouchoux, F., Degryse, M., Lecaque, D., Petit, F., & Gaillard, M., 1999. The pharmacological profile of a novel norpregnane progestin (trimegestone). Gynecological Endocrinology, 13(5), 316-326.
Schriks, M., Heringa, M. B., & van der Linden, S. C., 2009. Temporal variation in multiple hormonal activities of surface waters located in the Dutch part of the Rhine basin. Association of Rhine Waterworks - RIWA, The Netherlands, pp. 24.
Sonneveld, E., Pieterse, B., Schoonen, W. G., & van der Burg, B., 2011. Validation of in vitro screening models for progestagenic activities: inter-assay comparison and correlation with in vivo activity in rabbits. Toxicology in Vitro, 25(2), 545-554.
Van der Linden, S. C., Heringa, M. B., Man, H. Y., Sonneveld, E., Puijker, L. M., Brouwer, A., & Van der Burg, B., 2008. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environmental Science & Technology, 42(15), 5814-5820.
Viswanath, G., Halder, S., Divya, G., Majumder, C. B., & Roy, P., 2008. Detection of potential (anti)-progestagenic endocrine disruptors using a recombinant human progesterone receptor binding and transactivation assay. Molecular and Cellular Endocrinology, 295(1), 1-9.
Přílohy volně vložené
-
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata, tabulky
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Studentka Bc. Petra Beranová seznámila komisi se svou diplomovou prací.
Tajemník komise, doc. Ing. Martin Kocour, Ph.D., seznámil komisi s posudkem vedoucího a oponenta diplomové práce. Následně student zodpověděl doplňující otázky.
Proběhla diskuze na téma práce. Studentka adekvátně a správně reagovala na vznesené dotazy členů komise. Komise se při hodnocení ztotožnila s návrhy posuzovatelů práce (vedoucího a oponenta) a dohodla se na výsledku obhajoby níže.